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1.基(ji)本信(xin)息
(1)品系(xi)名称：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst
(2)常用名：NPG小鼠
(3)背景：NOD
(4)毛色：白色
(5) 品(pin)系建立(li)：NPG小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)，是北京维通达生物技术有限公司自主研发的一(yi)系列高(gao)度免(mian)疫缺(que)陷大小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)模(mo)型(xing)之(zhi)一(yi)，将获得的Il2rg基因敲除(chu)小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)，回(hui)交到(dao)NOD-scid背(bei)景建立的高(gao)度免(mian)疫缺(que)陷模(mo)型(xing)。使用该小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)模(mo)型(xing)已经发表了一(yi)系列高(gao)水平研究论文[1~12]。
2.制作(zuo)简介
首先构建了Il2rg基因打靶载体，在B6/129 F1背景的ES细胞上，筛选得到将Il2rg基因敲除的阳性打靶细胞（见图1）。通过囊胚注射的方法，获得了Il2rg基因敲除的ES嵌合小鼠。然后，将ES打靶小鼠，与NOD-scid小鼠回交，从后代中选择Il2rg因基敲除鼠，再与NOD-scid小鼠回交。通过12代的回交，获得并选择Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配，获得PrkdcscidIl2rg-/-小鼠。随后，NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 小鼠按照近交系的方式扩繁生产。
图1. Il2rg 基因打靶策略示意图
3.质(zhi)控检测和(he)表型(xing)分析
NPG小(xiao)鼠主(zhu)要包括两个(ge)基因(yin)(yin)突变(bian)(bian)，（1）Prkdc基因(yin)(yin)的(de)点突变(bian)(bian)，在84号外显(xian)子(zi)上，TAT→TAA，产生(sheng)了一个(ge)无(wu)效(xiao)的(de)包含(han)83AA的(de)删短蛋(dan)白；（2）Il2rg基因(yin)(yin)小(xiao)鼠，3-8外显(xian)子(zi)的(de)编码(ma)区被删除。NPG小(xiao)鼠的(de)SNP分析结果见(jian)表1，与NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)小鼠一致。
表1. NPG 和NOD-scid 小鼠SNP分析结果。
SNP ID | Chr-cM | Allele | NPG | NOD-scid | |
1 | RS8253473-SNP1 | 1-80 | V=A, F=C | F F | F F |
2 | RS13476104-SNP1 | 1-128 | V=C, F=T | V V | V V |
3 | RS13476435-SNP1 | 2-35 | V=A, F=T | F F | F F |
4 | RS13476730-SNP1 | 2-119 | V=A, F=T | V V | V V |
5 | RS13477470-SNP1 | 3-146 | V=A, F=G | V V | V V |
6 | RS13478001-SNP1 | 4-135 | V=C, F=T | V V | V V |
7 | RS13478215-SNP1 | 5-42 | V=A, F=C | F F | F F |
8 | RS13459087-SNP1 | 5-86 | V=A, F=G | F F | F F |
9 | RS13478818-SNP1 | 6-73 | V=C, F=G | F F | F F |
10 | RS3710839-SNP1 | 6-121 | V=A, F=G | V V | V V |
11 | RS3666902-SNP1 | 7-15 | V=T, F=C | VV | VV |
12 | RS8260975-SNP1 | 7-34 | V=A, F=C | V V | V V |
13 | RS13479791-SNP1 | 8-60 | V=A, F=G | F F | F F |
14 | RS4227276-SNP1 | 8-80 | V=C, F=T | F F | F F |
15 | RS8254841-SNP1 | 9-38 | V=A, F=T | F F | F F |
16 | RS13480385-SNP1 | 9-103 | V=C, F=T | V V | V V |
17 | RS13480546-SNP1 | 10-24 | V=C, F=T | F F | F F |
18 | RS13480803-SNP1 | 10-123 | V=C, F=T | V V | V V |
19 | RS13480933-SNP1 | 11-25 | V=C, F=G | V V | V V |
20 | RS3653651-SNP1 | 11-102 | V=C, F=T | F F | F F |
21 | RS13481624-SNP1 | 12-99 | V=C, F=G | F F | F F |
22 | RS13481852-SNP1 | 13-63 | V=A, F=C | V V | V V |
23 | RS13482131-SNP1 | 14-30 | V=C, F=T | V V | V V |
24 | RS13459176-SNP1 | 15-3 | V=A, F=C | V V | V V |
25 | RS4170048-SNP1 | 16-32 | V=C, F=G | V V | V V |
26 | RS13482843-SNP1 | 17-4 | V=C, F=T | V V | V V |
27 | RS13483295-SNP1 | 18-35 | V=G, F=T | V V | V V |
28 | RS13483601-SNP1 | 19-34 | V=A, F=G | F F | F F |
29 | RS13483739-SNP1 | X-40 | V=C, F=T | V V | V V |
30 | RS13483962-SNP1 | X-109 | V=A, F=C | F F | F F |
NOD(non-obese diabetes) 背景(jing)适宜人(ren)源细(xi)(xi)胞(bao)(bao)移植(zhi)[13]；Prkdc基(ji)因突(tu)变，小鼠T、B细(xi)(xi)胞(bao)(bao)缺失(shi)[14,15]；Il2rg蛋白的gamma链被(bei)敲(qiao)除，其NK细(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)力几乎丧失(shi)[16,17]。因而其基(ji)因检(jian)测(ce)(ce)和(he)表型分析主要(yao)集中在(zai)4个方面：①NOD背景(jing)（SNP检(jian)测(ce)(ce)）；②Prkdc点突(tu)变（PCR检(jian)测(ce)(ce)；T、B细(xi)(xi)胞(bao)(bao)缺失(shi)的流式检(jian)测(ce)(ce)）；③Il2rg敲(qiao)除（PCR检(jian)测(ce)(ce)，功能性NK细(xi)(xi)胞(bao)(bao)缺失(shi)的流式检(jian)测(ce)(ce)）；④细(xi)(xi)胞(bao)(bao)移植(zhi)重建(jian)分析。
(1) NOD背(bei)景检测 ;
NPG小鼠制作使(shi)用(yong)的NOD-scid小(xiao)鼠，其遗(yi)传(chuan)检(jian)测数据见右上30个SNP(single nucleotide polymorphism)位点(dian)信息表，这些(xie)位点(dian)遗(yi)传(chuan)标记分布于20条染(ran)色体。
(2) Prkdc点突变、Il2rg敲除和NOD背(bei)景（Sirpa基因(yin)）检测
Prkdc点(dian)突变小鼠， 1983年由福克斯(si)蔡斯(si)癌症(zheng)中(zhong)心（Fox Chase Cancer Centre）的(de)(de)(de)(de)Bosma等人发(fa)现[14,15]。Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的(de)(de)(de)(de)T和(he)B细胞(bao)缺失(shi) ，表现为(wei)细胞(bao)免(mian)疫和(he)体液免(mian)疫的(de)(de)(de)(de)重度(du)联合免(mian)疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。Il2rg敲(qiao)(qiao)除(chu)小鼠表现为(wei)胸(xiong)腺发(fa)育不(bu)全，NK细胞(bao)数量减少，活(huo)性丧失(shi)[16,17]。目前Prkdc点(dian)突变常用(yong)的(de)(de)(de)(de)检测(ce)方(fang)(fang)法为(wei)PCR检测(ce)；蛋白(bai)水平(ping)的(de)(de)(de)(de)检测(ce)比较方(fang)(fang)便(bian)的(de)(de)(de)(de)是(shi)流式分析(xi)其(qi)外周血中(zhong)T、B淋(lin)巴细胞(bao)的(de)(de)(de)(de)含量。Il2rg敲(qiao)(qiao)除(chu)常用(yong)的(de)(de)(de)(de)检测(ce)方(fang)(fang)法为(wei)PCR检测(ce)；蛋白(bai)水平(ping)的(de)(de)(de)(de)检测(ce)比较方(fang)(fang)便(bian)的(de)(de)(de)(de)是(shi)流式分析(xi)其(qi)脾脏中(zhong)NK细胞(bao)的(de)(de)(de)(de)含量和(he)活(huo)性。NPG小鼠采用(yong)上述(shu)方(fang)(fang)法进(jin)行质控，结果见下图。
图2 Prkdc基因PCR检测 图3 Il2rg基因PCR检测(ce)
图4 NOD背景（Sirpa基因）检测
(3) T、B和(he)NK细胞(bao)检测
图5 NPG小鼠缺失有功(gong)能的T、B和(he)NK细胞(bao)(bao)。流式(shi)分析B6, Balb/c nude和(he)NPG小鼠外周(zhou)血中CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 细胞(bao)(bao) , B220+ B 细胞(bao)(bao)和(he)NKp46+ NK 细胞(bao)(bao)的含量(liang)。
(4) 造(zao)血干细胞移植(zhi)重(zhong)建和肿瘤细胞移植(zhi)数(shu)据
① NPG小鼠移植人造血干细胞效(xiao)果显著优(you)于(yu)NOD-scid小鼠。
图6 NPG和NOD-scid小鼠移(yi)植人(ren)造(zao)血干细(xi)(xi)胞(bao)，第(di)12周(zhou)(zhou)时人(ren)CD45+细(xi)(xi)胞(bao)嵌合率分析(xi)。左图为(wei)(wei)移(yi)植后12周(zhou)(zhou)时外周(zhou)(zhou)血中人(ren)CD45+细(xi)(xi)胞(bao)比(bi)例的流(liu)式分析(xi)结果；右图为(wei)(wei)骨髓中人(ren)CD45+细(xi)(xi)胞(bao)的比(bi)例。
②人造(zao)血干细胞（HSCs）移植NPG小鼠高水平重建造(zao)血系统
图7 NPG小鼠移植人(ren)造(zao)血(xue)干细胞（HSCs）后(hou)，可以高水平(ping)重建造(zao)血(xue)系(xi)统(tong)。左(zuo)图为将(jiang) 5×104脐(qi)带血(xue)CD34+细胞通过骨髓移植入6-8周(zhou)的NPG小(xiao)鼠后检测结果; 右图为1×105脐带血CD34+细(xi)胞(bao)移植后16周在NPG小鼠脾脏中检(jian)测(ce)到高水平的人CD45+细(xi)胞(bao)
③人造血(xue)干细胞（HSCs）移植NPG小鼠(shu)后重建各系(xi)造血(xue)细胞比例检测
图(tu)8人(ren)造血(xue)干细胞（HSCs）移植NPG小鼠(shu)后获得各系造血(xue)细胞分化(hua)的高水平重(zhong)建。上图(tu)显(xian)示的为将(jiang)5×104脐带血(xue)CD34+细胞移植16周后，在(zai)NPG小鼠(shu)外周血(xue)中检测到高水平的人(ren)CD45+细胞（46.54%）、CD19+ B细胞（70.9%）、CD3+ T细胞（17.33%）和CD33+髓系细胞（8%）。
图9 人(ren)造血(xue)干细(xi)胞(bao)(bao)（HSCs）移植NPG小(xiao)鼠后各(ge)系细(xi)胞(bao)(bao)重建。脐带血(xue)CD34+细(xi)胞(bao)(bao)移植NPG小(xiao)鼠12周(zhou)以及(ji)更长时间(jian)之(zhi)后，人(ren)源造血(xue)细(xi)胞(bao)(bao)稳定重建，T细(xi)胞(bao)(bao)所占(zhan)比例逐渐(jian)升高。
④NPG小鼠(shu)肿瘤免疫治(zhi)疗的相关研究
图10 人肿瘤细胞移植NPG小鼠后更容易成瘤。上图为使用NPG小鼠和BALB/c裸鼠，皮下接种人黑色素瘤细胞A375SM后，活体成像的肿瘤示踪图，可见NPG小鼠成瘤，与裸鼠相比，大小更均匀，生长到一定体积需要的时间相对更短。
4. 应(ying)用(yong)领域
（1）人源细胞或(huo)组织移植(zhi)
（2）肿瘤和肿瘤干细胞研究
（3）ES和iPS细胞研究
（4）造血和免疫学研究
（5）人类疾病感染模型研究
（6）人源化动物模型研发
5. 参考文(wen)献(xian)
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