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基因编辑类(lei)型
根据研究的(de)(de)不(bu)同(tong)目的(de)(de)，需要制(zhi)备不(bu)同(tong)的(de)(de)的(de)(de)动物模(mo)型(xing)(xing)(xing)。当为(wei)了研究基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)功能时(shi)(shi)需要过(guo)表达或敲除(chu)(chu)相(xiang)应基(ji)因(yin)(yin)。如果全身敲除(chu)(chu)目的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)会导致动物死亡时(shi)(shi)，或需要在(zai)特(te)定的(de)(de)组织(zhi)敲除(chu)(chu)基(ji)因(yin)(yin)时(shi)(shi)，可(ke)以(yi)制(zhi)备条(tiao)件敲除(chu)(chu)小(xiao)(xiao)鼠。为(wei)了建(jian)立基(ji)因(yin)(yin)突(tu)变(bian)模(mo)型(xing)(xing)(xing)时(shi)(shi)，制(zhi)备点突(tu)变(bian)动物模(mo)型(xing)(xing)(xing)。制(zhi)备基(ji)因(yin)(yin)人(ren)源化小(xiao)(xiao)鼠时(shi)(shi)，可(ke)以(yi)进行人(ren)源基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)替换。制(zhi)备不(bu)同(tong)的(de)(de)动物模(mo)型(xing)(xing)(xing)，需采用相(xiang)应的(de)(de)策(ce)略(lve)，才(cai)能成功获得目标模(mo)型(xing)(xing)(xing)。
基(ji)(ji)因敲(qiao)(qiao)除是研(yan)究基(ji)(ji)因功能的(de)重要方法。传(chuan)统ES打靶敲(qiao)(qiao)除方法，周期长(zhang)，费用高。CRISPR/Cas9在基(ji)(ji)因敲(qiao)(qiao)除方面的(de)优势(shi)：效率高，时间短，24天直(zhi)接(jie)获(huo)得基(ji)(ji)因敲(qiao)(qiao)除小鼠。
技(ji)术一(yi)般的流程
设计(ji)合成gRNA→ 显微注射→ 小鼠(shu)出生(sheng)检测。
技术优势或(huo)适合应用的研(yan)究(jiu)
-效率高，可达90%的敲除效率，并且有一定纯合敲除比例。
-方便检测，从PCR条带的大小，容易区分是否发生敲除。
-时间短，24天获得基因敲除小鼠。
-不受敲除片段大小限制，从几十bp到Mb长度的DNA,都能有效敲除。
成功案例
图1：两个Grna切割位点(dian)之间的(de)(de)~550bp基因序列被敲除(chu)(chu)，PCR检(jian)测(ce)，相对于野(ye)生(sheng)带(dai)773bp，发生(sheng)敲除(chu)(chu)的(de)(de)鼠(shu)产生(sheng)~220bp的(de)(de)条带(dai)（箭头指向的(de)(de)条带(dai)）。
当基(ji)因(yin)敲除(chu)会(hui)导(dao)致(zhi)小(xiao)(xiao)鼠(shu)死亡时，需要条(tiao)件敲除(chu)，才能获得成体小(xiao)(xiao)鼠(shu)用于研究。条(tiao)件敲除(chu)一般使(shi)(shi)用Cre-loxp系统，其方(fang)法(fa)是在(zai)基(ji)因(yin)的(de)(de)关键区域的(de)(de)两(liang)侧，插入loxp。loxp小(xiao)(xiao)鼠(shu)制(zhi)备好后(hou)，与(yu)Cre小(xiao)(xiao)鼠(shu)杂交，获得loxp纯合，Cre阳性的(de)(de)小(xiao)(xiao)鼠(shu)，这种小(xiao)(xiao)鼠(shu)在(zai)Cre的(de)(de)作用下，loxp发生(sheng)重组，中间(jian)的(de)(de)序(xu)列被删(shan)除(chu)，达到(dao)敲除(chu)基(ji)因(yin)的(de)(de)目(mu)(mu)的(de)(de)。目(mu)(mu)前已(yi)经有数百(bai)种Cre工具小(xiao)(xiao)鼠(shu)，可以(yi)根据研究需要，购买或定制(zhi)Cre工具鼠(shu)，在(zai)不同的(de)(de)组织(zhi)器官(guan)，达到(dao)敲除(chu)目(mu)(mu)的(de)(de)基(ji)因(yin)。Cre融合ER/ERT2后(hou)，可以(yi)使(shi)(shi)用tamoxifen调控(kong)Cre入核(he)，实现(xian)时间(jian)上的(de)(de)调控(kong)删(shan)除(chu)。
图1：通过CRISPR辅助，在关(guan)键(jian)外显(xian)(xian)子(zi)的两侧通过同源重(zhong)组，插(cha)入两个loxp，在Cre的作用下(xia)，loxp之间的外显(xian)(xian)子(zi)被删(shan)除(chu)，实现基(ji)因条(tiao)件敲除(chu)。
技(ji)术一般的流程
打靶(ba)载体设计→ ;载体构建→ 显微注(zhu)射(EPS打靶(ba))→ 小鼠鉴(jian)定。
技术优势(shi)或适合(he)应用的(de)研究
-用于敲除致死的基因
-非致死基因，用条件敲除也可以在不同的组织，不同的时间敲除基因，获得更多的实验数据。
成功案例
图2：在关键外(wai)显子或非3整数(shu)倍的外(wai)显子两(liang)侧敲入loxp,在Cre的作用下，该区域被删除(chu)，导致基(ji)因敲除(chu)。
图3：设计Loxp插(cha)入位(wei)(wei)点的(de)特异引物与同源臂外侧的(de)引物，通(tong)过(guo)PCR，可(ke)以检测到两个loxp被正确(que)敲入到目的(de)位(wei)(wei)置，证(zheng)明获(huo)得条件敲除小(xiao)鼠。
随(sui)机(ji)转基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)是一(yi)种经(jing)典的过(guo)(guo)表(biao)达基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)小鼠(shu)制备策略(lve)，不同于靶向基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)编辑，没有受(shou)到(dao)新兴基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)编辑技术(shu)的影响。该方法通过(guo)(guo)将基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)随(sui)机(ji)整合到(dao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)组中，实现(xian)目(mu)的基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)过(guo)(guo)表(biao)达。
技术一般的流程
过表达载体构建(jian)(jian)→ 显(xian)微注射→ 小鼠鉴定筛(shai)选→ 表达检测→ 品(pin)系(xi)建(jian)(jian)立。
图(tu)1：转基因载体和小鼠制(zhi)备流程。
技术优势或适合(he)应(ying)用(yong)的研究
-可以广谱，或组织特异过表达目的基因。
-多拷贝插入，比定点插入表达量更高。
-受整合位置影响，可能表达沉默，或者表达谱错误。
成功案例
图2：通过转(zhuan)基(ji)因载体特(te)异的引物(wu)设计，检测到转(zhuan)基(ji)因阳(yang)性的小鼠，一般效(xiao)率在10-20%。
定点(dian)(dian)转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)是(shi)将转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)载体敲(qiao)入(ru)到Rosa26位点(dian)(dian)，该位点(dian)(dian)被(bei)证明是(shi)在(zai)所有组织(zhi)细胞都活(huo)跃的(de)区域，不会发生随(sui)机转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)出(chu)现(xian)的(de)转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)沉默的(de)现(xian)象。常用来制作过(guo)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)或条(tiao)件(jian)过(guo)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)小(xiao)鼠(shu)(shu)。条(tiao)件(jian)过(guo)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)是(shi)在(zai)目的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)前面插入(ru)loxp包围的(de)Stop序(xu)(xu)列(lie)，阻止目的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)。该小(xiao)鼠(shu)(shu)模型与Cre小(xiao)鼠(shu)(shu)杂交，能(neng)够(gou)在(zai)Cre表(biao)(biao)达(da)(da)(da)的(de)组织(zhi)中(zhong)，删除(chu)Stop序(xu)(xu)列(lie)，从而使目的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)发生表(biao)(biao)达(da)(da)(da)；过(guo)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)小(xiao)鼠(shu)(shu)直接获得(de)组成性基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)达(da)(da)(da)小(xiao)鼠(shu)(shu)。维(wei)通达(da)(da)(da)的(de)Rosa26位点(dian)(dian)的(de)定点(dian)(dian)转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)系(xi)统，已经实现(xian)长达(da)(da)(da)10kb的(de)定点(dian)(dian)转(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)。
图1：Rosa26位置敲入转(zhuan)基(ji)因(yin)表达载体，制备(bei)定点(dian)转(zhuan)基(ji)因(yin)小鼠.
基(ji)因(yin)(yin)(yin)敲入是(shi)指在基(ji)因(yin)(yin)(yin)组的特定位置插入一段DNA序列，例如给基(ji)因(yin)(yin)(yin)加(jia)GFP荧光标签标记蛋白，原位敲入制备Cre工具鼠(shu)等(deng)应用(yong)。1kb以下的小片段插入，CRISPR/Cas9效率较高。对于大片段的基(ji)因(yin)(yin)(yin)插入，需要(yao)使用(yong)ES，或者EPS制备策略才能保证项(xiang)目周期和效率。
图1：把(ba)绿色荧光(guang)蛋白(bai)敲(qiao)入目(mu)的(de)(de)基(ji)因(yin)的(de)(de)C端，融合表达，示(shi)踪目(mu)的(de)(de)基(ji)因(yin)。
技术一般的流程(cheng)+图解
打靶(ba)载体设计→ 载体构(gou)建→ 显(xian)微(wei)注射(EPS打靶(ba))→ 小鼠鉴定。
技(ji)术优势或适(shi)合(he)应用(yong)的研究(jiu)
-CRISPR用于(yu)小片段的基因敲入。
-ES/EPS用于(yu)大片段(duan)基因敲入。
-给基(ji)因(yin)加各种标签，原位敲入制备Cre工具鼠。
基(ji)因替(ti)换(huan)指，根据研究需要，将(jiang)小鼠的(de)(de)基(ji)因替(ti)换(huan)为其它物(wu)种的(de)(de)基(ji)因。可(ke)以将(jiang)基(ji)因的(de)(de)部分功(gong)能区，或(huo)者全基(ji)因进(jin)行替(ti)换(huan)。1kb以下的(de)(de)小片(pian)段(duan)替(ti)换(huan)，可(ke)以采用(yong)CRISPR/Cas9策略。对于大片(pian)段(duan)的(de)(de)基(ji)因替(ti)换(huan)，需要使(shi)用(yong)ES，或(huo)者EPS制(zhi)备策略才能成功(gong)。
图1：用其它种(zhong)系的基(ji)因，替换小鼠的基(ji)因片段。
技术一般的流程(cheng)+图解
打靶(ba)载体设计(ji)→ 载体构(gou)建→ 显微(wei)注(zhu)射(EPS打靶(ba))→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合(he)应用的(de)研究
-CRISPR用于小片段的基因替换。
-ES/EPS用于(yu)大(da)片段基因替换。
3)基因人源(yuan)化(hua)小鼠(shu)的制备，如PD1等(deng)免疫(yi)检查点(dian)人源(yuan)化(hua)小鼠(shu)的制备。
图1 EPS小片段敲入(ru)效率(lv)高达90%。
图(tu)2 EPS系(xi)统对于长达20kb的大片段敲入，也具有(you)很高(gao)的效(xiao)率。
许多疾(ji)病(bing)由氨基(ji)酸突变引起(qi)，为了(le)构建此(ci)类疾(ji)病(bing)模型，可以(yi)将小鼠的对应基(ji)因的位点进行突变。单(dan)链DNA在点突变方面有较(jiao)高(gao)的成功率。
图1 单链DNA模板制备(bei)点突变小鼠。
图2 PCR扩增包含突变位点的序列，测序检测发生点突变的小(xiao)鼠，目标碱(jian)基出现套(tao)峰，证明获(huo)得杂(za)合突变小(xiao)鼠。
技术一(yi)般的(de)流程
gRNA设(she)计→ 供体DNA合成→ 显(xian)微注射(she)(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-氨基酸突变类小鼠疾病模型模拟
-CRISPR点突变效率相对较高
